PCR基因擴增實驗室建設

    PCR基因擴增實驗室介紹和標準：

    PCR實驗室又叫基因擴增實驗室。PCR是聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)的簡稱。是一種分子生物學技術，用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復制。通過DNA基因追蹤系統，能迅速掌握患者體內的病毒含量，其精確度高達納米級別。

    PCR實驗室必須建立嚴格的實驗室管理制度、建立標準化操作程序（SOP）、建立系列質量管理文件等，確保實驗室日常運行符合國家衛生部的要求，確保檢測結果準確、確保實驗室衛生安全，確保實驗室長期穩定運行.

PCR設計規范 /PRINCIPLES

配置原則	室全PCR線實驗(高檔實驗室)	標準PCR實驗室（中檔實驗室）	普通實驗室（普通實驗室）	測序實驗室（�？茖嶒炇遥�
開展項目	涵蓋了目前分子生物學能開展所有項目，達到國內甚至國際一流CR實驗室水平。	檢測項目齊全，涵蓋了目前臨床需求的常規檢測項目，達到國內PCR標準實驗室的檢測水平。	臨床科室或小型醫院開展PCR項目，檢測項目滿足臨床需求，達到或達不到國內PCR標準實驗室的標準。	開展測序的所有檢測項目，達到標準PCR實驗室水平
項目先進性	除開展常規的檢測項目外，還需開展高端項目，如測序項目、超敏PCR項目、腫瘤檢測等高端項目。	開展項目技術性能基本滿足臨床需求，達到國內PCR標準實驗室的檢測水平。	開展項目技術性只能滿足科室或小型醫院的當前需求，不具有先進性。	國內外最先進的PCR測序檢測項目，達到個體化診療的需求。
人員要求	至少有兩人，除經過普通PCR上崗培訓外，要具有測序項目檢測實驗及結果分析能力。	至少有兩人，除經過普通PCR上崗培訓外，要具有測序項目檢測實驗及結果分析能力。	至少有兩人，除經過普通PCR上崗培訓外，要具有測序項目檢測實驗及結果分析能力。	至少有兩人，除經過普通PCR上崗培訓外，要具有測序項目檢測實驗及結果分析能力。

PCR基因擴增實驗室技術參數：

區域	壓力	溫度	相對濕度	照明
PCR走廊	+5-0Pa	20-26度	40-60%RH	主實驗室≥300LX，其余房間20-300LX
PCR試劑準備區	+10Pa
PCR樣品制備區	+15Pa
PCR擴增及擴增產物分析區	-15-250Pa

基因擴增檢驗實驗室平面布局
 1）臨床基因擴增檢驗實驗室區域設置原則

1、 試劑儲存和準備區  

2、 標本制備區

3、 擴增反應混合物配制和擴增區

4、 擴增產物分析區（如使用全自動分析儀，區域可適當合并。）

  2） 各工作區域必須有明確的標記，避免不同工作區域內的設備、物品混用。
  3） 進入各工作區域必須嚴格按照單一方向進行，即試劑儲存和準備區 —>標本制備區—>擴增反應混合物配制和擴增區—>擴增產物分析區。
 4） 不同的工作區域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開各工作區域時，不得將工作服帶出。

PCR擴增檢驗實驗室原則上分為三個單獨的工作區域：試劑貯存和準備區、標本制備區、擴增和擴增產物分析區。為避免交叉污染，進入各個工作區域必須嚴格遵循單一方向進行，即只能從試劑貯存和準備區→標本制備區→擴增和擴增產物分析區。各實驗區之間的試劑及樣品傳遞應通過傳遞窗進行。

(1)試劑貯存和準備區
該實驗區主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。試劑和用于樣品制作的材料應直接運送至該區，不得經過其他區域。試劑原材料必須貯存在本區內，并在本區內制備成所需的貯存試劑。對與氣流壓力的控制，本區應對外界保持微正壓。

　(2)標本制備區
該區域主要進行的操作為樣本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定DNA的合成。本區的壓力梯度要求為：相對于鄰近區域為正壓，以避免從鄰近區進入本區的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會發生氣溶膠所致的污染，所以應避免在本區內不必要的走動。

(3-4)擴增和擴增產物分析區
　　該區域主要進行的操作為DNA擴增和擴增片段的測定。此外，已制備的DNA模板(來自樣本制備區)的加入和主反應混合液(來自試劑貯存和制備區)制備成反應混合液等也可在本區內進行。本區的壓力梯度要求為：相對于鄰近區域為負壓，以避免氣溶膠從本區漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應盡量減少在本區內的不必要的走動。個別操作如加樣等應在超凈臺內進行。

   PCR區完成以后，需要分析樣品并解釋數據，應該留出一個專門用于反應后處理樣品的地方。后PCR活動中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門用于這一目的，決不能把實驗室這一區域的試劑或儀器用于任何前PCR活動。產物分析區如使用全自動分析儀，區域可適當合并。

(5)緩沖區與沖洗區
整個區域有一個整體緩沖走廊。每個獨立實驗區設置有緩沖區，同時各區通過氣壓調節，使整個PCR實驗過程中試劑和標本免受氣溶膠的污染并降低擴增產物對人員和環境的污染。

可打開緩沖區Ⅰ，緩沖區Ⅱ和 PCR 擴增區的排風扇往外排氣，在實驗區的外墻上和各扇門上都安裝有風量可調的回風口，空氣通過回風口向室內換氣。外面有用于實驗后消毒，消毒區域有專用清洗液和專用潔凈洗手池，以及消毒紙巾。

若房間進深允許，可設PCR內部專用走廊。需要指出的是在減少室內外空氣交換方面，緩沖間比專用走廊更有意義。
    各個區域之間應具備單向的實驗工藝流、物流、人流與氣流，形成單向流程的保護屏障，避免實驗之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠對實驗過程造成污染產生假性結果。

PCR實驗室建設

1、主體結構：
主體為彩鋼板、鋁合金型材。室內所有陰角、陽角均采用鋁合金50內圓角鋁，從而解決容易污染、積塵、不易清掃等問題。結構牢固，線條簡明，美觀大方，密封性好。
 2、 標準的三區分隔和氣壓調節：
將PCR過程分成試劑準備、標本制備和PCR擴增、分析三個（或）四個獨立的實驗區。整個區域有一個整體緩沖走廊。每個獨立實驗區設置有緩沖區，同時各區通過氣壓調節，使整個PCR實驗過程中試劑和標本免受氣溶膠的污染并降低擴增產物對人員和環境的污染。
可打開緩沖區Ⅰ，緩沖區Ⅱ和 PCR 擴增區的排風扇往外排氣，在實驗區的外墻上和各扇門上都安裝有風量可調的回風口，空氣通過回風口向室內換氣。

3、 消毒：
在三個實驗區和三個緩沖區頂部以及傳送窗內部安裝有紫外燈，供消毒用。在試劑準備區和標本制備區 還設置移動紫外線燈，對實驗桌進行局部消毒。
4、 機械連鎖不銹鋼傳遞窗：
試劑和標本通過機械連鎖不銹鋼（不建議使用電子連鎖方式）傳遞窗傳遞，保證試劑和標本在傳遞過程中不受污染（人物分流）。
5、 地面
地面建議使用PVC卷材地面或自流坪地面，整體性好。便于進行清掃，耐腐蝕。沒有條件的也可采用水磨石地面，或大塊的瓷磚（至少800mm×800mm）接縫需要小于2mm。

6、 照明
燈具要選用凈化燈具，能達到便于清洗、不積塵的特點。

PCR實驗室可以是分散形式，也可以是組合形式。完成一組PCR實驗，通常應經過試劑配制、樣品處理、核酸擴增及產物分析四個實驗過程，若實驗工藝需要，還應增加樣品粉碎過程。
一、分散形式PCR實驗室
    所謂分散形式PCR實驗室，是指完成上述實驗過程的實驗用房彼此相距較遠，呈分散布置形式。對于這種布置形式的PCR實驗室，由于各個實驗之間不易相互干擾，因此無需特殊條件要求。

二、組合形式PCR實驗室
    所謂組合形式PCR實驗室, 是指完成PCR四個實驗過程的實驗用房相鄰布置，組成獨立實驗區域的形式。對于組合形式PCR實驗室，由于各個實驗間集中布置，容易造成相互干擾，因此，對總體布局以及屏障系統具有一定的要求。各室在入口處設緩沖間，以減少室內外空氣交換。試劑配制室及樣品處理室宜呈微正壓，以防外界含核酸氣溶膠的空氣進入，造成污染；核酸擴增室及產物分析室應呈微負壓，以防含核酸的氣溶膠擴散出去污染試劑與樣品。
如果使用熒光PCR儀，擴增室和產物分析室可以合并。
    若房間進深允許，可設PCR內部專用走廊。需要指出的是在減少室內外空氣交換方面，緩沖間比專用走廊更有意義。
    各個區域之間應具備單向的實驗工藝流、物流、人流與氣流，形成單向流程的保護屏障，避免實驗之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠對實驗過程造成污染產生假性結果。  
實驗室的墻體，包括頂棚，應結構牢固、氣密性好；所有陰角宜采用圓弧形線條過渡；墻體內壁光潔、不吸附、耐腐蝕、易清洗消毒；地面材料應滿足無縫隙、無滲漏、光潔、耐腐蝕的要求.。

PCR實驗室各區域管理規定：

試劑準備區工作制度  
 一、實驗人員進入該區須更換工作服，穿本區專用綠色工作服， 戴帽子、口罩及更換專用拖鞋。 
二、實驗員在試劑準備區接收標本、準備實驗用的試劑。
 三、實驗員每天收齊標本，驗收登記后，將標本通過傳遞 窗送入標本制備區。  四、在試劑準備區配置好試劑后放入冰箱內備用。需要時 通過傳遞窗送入標本制備區。 
五、每天的標本及配置的試劑須登記記錄，應書寫工整詳 細，使用本區專用的、帶有本室標識的記錄本、紙和筆。
 六、將本區廢棄物裝入本室垃圾袋中，有專人將垃圾帶出 實驗室交醫院集中處理。
 七、實驗后須使用含氯消毒液及75%的乙醇擦拭實驗臺 面，紫外燈消毒30分鐘，記錄紫外燈、冰箱、離心機等儀器的使用情況。

標本制備區工作制度   
 一、實驗人員進入該區須更換工作服，穿上本區專用藍色工作服， 戴帽子、口罩及更換專用拖鞋。
 二、把已準備好的試劑放入冰箱試劑存放專區暫存。
 三、記錄溫濕度計讀數、冰箱的溫度。
 四、嚴格按照SOP文件及試劑盒要求進行實驗操作，加樣好的PCR 管須通過傳遞窗送入擴增及產物區。
 五、使用本區專用的移液器及吸頭，使用過的離心管、吸頭須置于 盛有含氯消毒液的廢液缸中，實驗完畢后及時處理。將本區廢棄物裝入本室垃圾袋中，有專人將垃圾帶出實驗室交醫院集中處理。
 六、使用本區專用的帶有本區標識的記錄本、紙和筆，其他區的用 品不得帶入本區。 
七、實驗完畢關閉所有儀器，記錄儀器使用時間和運行狀態。
 八、實驗后須使用含氯消毒液及75%的乙醇擦拭實驗臺 面，紫外燈消毒30分鐘，記錄紫外燈、冰箱、離心機等儀器的使用情況。     

擴增及產物分析區工作制度  
  一、實驗人員進入該區須更換工作服，穿上本區專用粉紅色 工作服，戴帽子、口罩及更換專用拖鞋。
 二、記錄溫濕度計讀數、冰箱的溫度。
 三、本區主要進行目的基因的擴增及分析，須熟悉各擴增儀 的使用，擴增分析完后，記錄結果。
 四、得到當天室內質控結果后，及時記錄在室內質控圖上并 進行分析。
 五、試驗完畢后關掉擴增儀，記錄儀器使用時間和運行狀態。
 六、每周由實驗室負責人對進行清潔維護并記錄。
 七、擴增分析完后的反應管，須裝入本室垃圾袋中，有專人 將垃圾帶出實驗室交醫院集中處理。 
八、使用本區專用的帶有本區標識的記錄本、紙和筆，其他區的用 品不得帶入本區。
 九、實驗后須使用含氯消毒液及75%的乙醇擦拭實驗臺面，紫外燈消毒30分鐘，記錄紫外燈、冰箱、離心機等儀器的使用情況。

PCR實驗室在操作時應注意事項

PCR（基因擴增實驗室）檢測微量感染因子時，操作人員容易因為污染而導致各種問題。進行PCR操作時，操作人員一定要嚴格遵守一些操作規程，最大程度地降低可能出現的PCR污染事故的發生。 

一、PCR實驗室劃分操作區： 

  目前，對于普通PCR，業內還無法做到單人單管和實現完全封閉管理操作，但無論是否能夠達到單人單管，均要求實驗操作在三個不同的物理區域內進行，PCR的前處理和后處理一定要設計在不同的隔離區內進行： 

1、標本處理區，包括：  擴增摸板制備;

2、PCR擴增區，包括：  反應液的配制和PCR基因擴增;

3、產物分析區，包括：凝膠電泳分析，產物拍照及重組克隆制備。  

各工作區要具有一定的隔離，操作器材要專用，而且要有一定方向性，如，標本制備→PCR擴增→產物分析→④產物處理。切記：產物分析區的產物及器材嚴禁拿到前后兩個工作區，避免交叉污染。 

二、PCR實驗室試劑分裝要求： 

  PCR擴增所需要的試劑均應在裝有紫外燈的負壓工作臺或超凈工作臺進行配制和分裝，所有的吸頭和加樣器都需固定放于其中，吸頭不能用來吸取擴增后的DNA和其它來源DNA：  

 1、PCR用水應為高壓的雙蒸水;

 2、引物和d-NTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴增產物區配制;

 3、引物和d-NTP應分裝儲存，分裝時應標明分裝時間，以備發生污染時及時查找原因和追溯污染源頭;

  三、PCR擴增重要標準

 1、PCR實驗靈敏度

  PCR實驗靈敏度：是指PCR擴增反應能夠檢測到目的基因的最小值。研究結果表明，影響PCR擴增效率的因素，有模板的完整性、反應溫度、復雜程度、引物純度及其與模板結合效率、DNA聚合酶的熱穩定性與擴增性能、反應緩沖液的離子組成(主要指： 陽離子)、反應優化劑等，這些因素都顯著影響

PCR實驗檢測靈敏度。在最佳擴增條件下，常規PCR反應能夠檢測到pg(10～12g)數量級目的基因。對于一個特定的目的基因，模板與引物通常都是已經限定好的因素。因此，選擇什么樣的PCR反應體系(包括DNA聚合酶與反應緩沖液等)就是研究者提高PCR實驗靈敏度的關鍵因素了。  

2、PCR實驗特異性

  PCR實驗特異性：是指在PCR擴增過程中，專一性擴增目的片段而非其他

片段的性能。 

    在PCR實驗本身的靈敏度很高，且實驗條件未充分優化的情況下，通常會在目的片段出現同時伴隨有其它雜帶，即發生非特異性擴增現象。模板、引物性質及質量、反應條件控制等均會影響PCR擴增特異性。近年來的研究結果表明，緩沖液品質(如反應優化劑、離子種類與組成等)對保證PCR特異性擴增起著重要作用。  

 3、PCR靈敏性和特異性關聯

  PCR實驗靈敏度與特異性是一對此長彼消特性，這也決定我們實驗體系調節實際上就是需要找到適合實驗靈敏度與特異性的平衡點。由于PCR體系中的成分眾多，使得組合較多，篩選工作也就相對繁雜。四、PCR實驗操作注意事項：  

  盡管PCR擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應導致的，但樣品間的交叉污染也是常見原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應時要謹慎對待，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環節都應謹慎操作，一般需做到以下幾點： 

 1、戴一次性手套，若不小心濺上反應液，應立即更換手套;

 2、避免反應液飛濺，若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面;

 3、使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免空氣中氣溶膠的污染;

4、操作多份樣品時，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后再分裝，這樣既可以減少操作次數，避免污染，又可以增加反應的精確度； 

5、最后加入反應模板，加入后蓋緊反應管;

6、操作時設立空白對照和陰陽性對照，既可驗證PCR反應的可靠性，又可

 以協助判斷擴增系統的可信性;

7、由于實際操作時加樣器很容易受產物氣溶膠或標本DNA的污染，所以操作者最好使用高壓處理過的或可替換的加樣器。 假如沒有這種特殊的加樣器，至少在PCR操作過程中加樣器應該專用，嚴禁交叉使用，尤其是PCR產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個相鄰區域使用;

8、重復實驗，驗證結果，慎下結論。 

五、綜述： 

  由于PCR實驗操作非常專業，在設計PCR基因擴增實驗室時設計師也要充分考慮上述技術要求，避免PCR實驗室在后續使用時出現返工、返修問題。